Extracción DNA bacterias Miniprep

Una miniprep es una extracción de ADN de naturaleza plasmídica de un cultivo bacteriano. El método más común para ello es romper las células de dicho cultivo mediante un choque alcalino de modo que sólo permee selectivamente su ADN plasmídico. Para ello, se toma un volumen de 2-5 mL de un cultivo crecido en medio líquido y se centrifuga, aislando así las células de aquél. Después, se resuspende dicho pellet y se expone dicha suspensión a una disolución que contiene NaOH y dodecilsulfato de sodio (SDS), la cual solubiliza en parte la membrana externa de las bacterias Gram negativas, lo que produce la liberación del contenido celular de éstas: ADN genómico y plasmídico desnaturalizados, ARN, proteínas... Tras esto, se añade a la mezcla acetato potásico, acídico, lo cual neutraliza todo el debris celular y provoca la rápida renaturalización del ADN plasmídico, que queda en suspensión, mientras que el genómico y el resto de componentes celulares se reticulan y precipitan ayudados por la alta concentración de sales, especialmente del recién generado dodecil sulfato de potasio. Finalmente, se centrifuga nuevamente la mezcla para aislar el sobrenadante, rico en el ADN plasmídico y en ARN, el cual deberá ser eliminado mediante una ribonucleasa.
La miniprep es la técnica inicial de purificación y concentración de ADN plasmídico para cualquiera de sus posibles fines, entre los que destaca la clonación.

•  
• Coger 1’5ml de cel y poner en un epp o centrifugamos el tubo y resuspendemos el pellet y añadimos 250ul Buffer P1; este buffer nos sirve para resuspender el pellet.
•   Vortex a los epp
• Add 250ul Buffer P2( para romper cel). Mover por inversión con energia, no mas de 5min. Al abrir el epp se verá “un moco”
• Add 350ul Buffer N3, resuspender por inversion. Para la reacción de lisis.
• Centrifugar 13’2rpm-10min. Queda un pellet que son las restas diferentes al DNA
•   Decantar el sobrenandante en una columna
• Centrifugar 13’2rpm-1min. Se une el DNA a la columna
• Decanto el sobrenante
• Add  750ul Buffer  PE
• Centrifugar 13’2rpm-1min
• Decantar sobrenadante
• Volver a centrifugar 13’2rpm-1min para eliminar el max de etanol
• Decantar sobrenadante
• Pasamos la columna a un epp nuevo y add 50ul de H2O por el centro de la columna para que quede bien empapado el filtro
• Dejo 1min RT
• Centrifugar 13’2rpm-1min
• Tiro la columna y me quedo con el epp que tiene el DNA
• Guardar a -20ºC.

*P1: Add el epp entero de 730ul RNase al Buffer P1; marcar con cruz y poner fecha. Guardar a 4ªC

• PE: Add el bote de 55ml a 220ml etanol, marcar con cruz y fecha. Guardar a tº ambiente.

* kit Quiagen . Plasmid DNA Purification Using the QIAprep Spin Miniprep Kit and Microcentrifuge.